Конструктивная критика: Авторы сами признают, что эксперимент по дифференциальному распределению белков

Question

Конструктивная критика: Авторы сами признают, что эксперимент по дифференциальному распределению белков

между ядром и цитоплазмой не сработал. "Despite the difference, Z-factor analysis indicated that the system was not sufficiently robust for large-scale screening purposes, leading us to seek an alternative [37].
"
Фосколин, из смеси, действительно может нормализовать работу лизосом за счёт модуляции синтеза и метаболизма сфинголипидов.
Химическое "перепрограммровпние" было опубликовано китайцами, лет 7-8 назад, даже в Science, но долгое время ни кто не мог воспроизвести их результаты. Была даже очень неприятная критика, в основном, достоверность.

Возраст донора клеток, если это не эмбрион или новорождённый, не влияет на судьбу клеток в культуре. Особенно после 20 лет.
Они как перепрограммируются (80-100 лет так же) в плюрипотентные, так и стареют репликативно, почти одинаково.

Отсутствуют ссылки на первичные данные о RNAseq. Они должны быть в открытом доступе. Nature journals обязывает всех авторов выкладывать такого рода данные .
Отсутствует вообще описание результатов RNAseq: какие транскрипты, названия? Их нет как тексте статьи, так и в supplements. Хотя весь проект построен на этой идее и результатах.

Рапамицин, указан в 100 nM. Это токсичная концентрация. Должна быть 1-5 nM
Среда для клеток, DMEM, это очень плохая среда, много аминокислот, идёт индукция mTOR и тд.

Нет коллагена.

Неконструктивная критика:
С какого х... Sinclair публикует в Aging? Где же понты?
Он более спорные данные публиковал в престижных журналах.
Значит, совсем всё плохо.

0

13.07.2023

18 ответов

41 просмотр

Sergei Vatolin Автор вопроса

Миша Иванов
А почему DMEM-f12 плохая среда для клеток? Можно п...

Постараюсь оставаться в тематике форума, Gene therapy. Традиционные среды были разработаны очень давно, 50-70 лет назад, и по составу очень далеки от плазмы крови. Например, в DMEM концентрация аминокислот в разы выше, чем нормальные концентрации аминокислот в крови человека. Пируват превышает в разы также. Много других отличий. Самый одиозный пример это Neurobasal medium, которая повсеместно используется для культивирования нейронов или схожих клеток: 70 мМ хлорид натрия! Это гипотонтческий раствор, осмолярное давление как-то слегка стабилизировали, но 70mM of sodium chloride! Как результат, испытание генных конструкций или фармакологии на клетках, в таких условиях, очень далеки от физиологических. В результате, очень низкая воспроизводимость на следующем этапе прикладных исследований (translational science), животной модели. Не говоря уже о клинических испытаниях. Решение . Были разработаны специальные среды, в US это HPLM, human plasma like medium. В Европе она по другому называется. Ссылки я скину. Эти среды имеют максимально приближенный к плазме крови состав. Как результат, повышенная предсказательная power модельных клеточных культур. Состав сред для сравнения я также скину в этот чат, если администратор не против.

0

14.07.2023

Anatolii Zubritckii

Sergei Vatolin
Постараюсь оставаться в тематике форума, Gene ther...

составы сред - это как раз самое интересное.

0

14.07.2023

Sergei Vatolin Автор вопроса

Миша Иванов
А почему DMEM-f12 плохая среда для клеток? Можно п...

Все эти новые среды доступны, около $65 за пол-литра. Самая приближенная к HPLM, это RPMI.

0

14.07.2023

Sergei Vatolin Автор вопроса

Anatolii Zubritckii
составы сред - это как раз самое интересное.

Сейчас скину свой Excel file.

0

14.07.2023

Kirill Lepik

Sergei Vatolin
Все эти новые среды доступны, около $65 за пол-лит...

Очень интересно. Скажите тогда пожалуйста, обсуждая например человеческие клетки, зачем же так много вариантов и модификаций сред если все клетки должны жить в человеческой плазме ? С другой стороны тканевая жидкость это же не плазма 🤔 наверное есть различия между тканями

0

14.07.2023

Sergei Vatolin Автор вопроса

Kirill Lepik
Очень интересно. Скажите тогда пожалуйста, обсужда...

Традиции и не желание входить в конфликт со старшими по званию. Строго говоря, даже Sabatini team призывает к пересмотру условий культивирования. Sabatini блольшой и влиятельный человек, как всегда fom Massachusetts. Я переключился на HPLM, и как говорится, совсем другие ощущения. Не просто уверенность в том что всё будет работать на мышах и человеке, а работает. Например, в тему чата, я много работаю с polyetheleneimine, branched and linear. Разные молекулярные веса, степень полимеризации. Эти вещества используются для доставки генных конструкций, но у них есть дополнительные биологические эффекты. Так вот PEIs, будут работать по разному в разных средах.

0

14.07.2023

Kirill Lepik

Sergei Vatolin
Традиции и не желание входить в конфликт со старши...

А что скажете по поводу разницы в составе тканевой жидкости в разных органах и тканях. Опять же например иммунные клетки должны вероятно работать в особых условиях среды воспалительных и тд и тп. Тема бесконечная, насколько велика доказательная база что новая среда лучше чем те по которым накоплен 50-70 летний опыт работы?

0

14.07.2023

Erdem Dashinimaev

Sergei Vatolin
Постараюсь оставаться в тематике форума, Gene ther...

В Европе вроде это Plasmax. Вобще вроде бы ещё MCDB131 более близко к плазме крови, чем DMEM , но могу ошибаться.

0

14.07.2023

Sergei Vatolin Автор вопроса

Kirill Lepik
Очень интересно. Скажите тогда пожалуйста, обсужда...

Но можно и более прагматично. Если, например, компания Р-Фарм или ей подобные, наоабатывают огромное количество терапевтических антител, то там нужна специальная среда. Культуры клеток очень плотные, им нужно много стнтезирвать белков и при этом не сдохнуть. Здесь нужны синтетические среды. Но если предполагается переход на животных, тогда нужно тестировать в HPLM, хотя бы на последнем этапе.

0

14.07.2023

Sergei Vatolin Автор вопроса

Kirill Lepik
А что скажете по поводу разницы в составе тканевой...

Проверить нужно, лучше среда или нет, 1-2 недели работы. И снова, если планируются животные, то HPLM. Если что-то наработать в культуре клеток, то синтетическая среда явно лучше. Вы правы, везде всё разное, но в культуре, на пластике, совсем другое. С первичными культурами клеток совсем всё сложно. И не только среды. Я пытаюсь создать 3D, матрикс, но это очень непросто. Коллаген укладывается по разному, при разной температуре и разном субстрате для укладки. Там непростая коллоидная химия и много физики. А клетки очень любят и уважают коллаген. Поэтому, возникает желание не суетиться и просто переключиться на мышей: там уже всё уложенно как надо и все межтканиаые жидкости сбалансированы.

0

14.07.2023

Oleg

А ее состав достоверно известен? В разных тканях сильные отличия?

0

14.07.2023

Kirill Lepik

Oleg
А ее состав достоверно известен? В разных тканях с...

Не знаю, но предполагаю что различен

0

14.07.2023

Natalia

Sergei Vatolin
Постараюсь оставаться в тематике форума, Gene ther...

Вы меня заставили задуматься с нейробазальной средой) Пошерстила, именно эту проблему со средой для нейронов пытаются решить. Вот здесь в статье сравнивали разные среды и изобрели новую среду с приближенным к ASCF составу (правда, полный состав не опубликовали). На основе этой статьи сделали коммерческую среду https://www.stemcell.com/products/brainphys-neuronal-medium.html. Вообще, у Термо есть новая нейробазальная среда Neurobasal Plus вроде как с лучшими электрофизиологическими свойствами нейронов, но её состав не нашла. Возможно, там тоже что-то в эту сторону сделано. Я использовала только Neurobasal A Medium для постнатальных нейронов, теперь вот думаю, так как созревание электрофизиологических свойств гиппокампальных нейронов в культуре и в срезах при тестировании в ASCF показывает постепенное отставание культивируемых нейронов.

0

02.08.2023

Natalia

Задала вопрос в Биоиннлабс по поводу их нейробазальной среды. Они сказали, что там 7 г/л NaCl, то есть получается 120 мМ. Мы уже получили пробники, но ещё не тестировали, посмотрим, интересно, что там будет.

0

03.08.2023

Владимир

Natalia
Задала вопрос в Биоиннлабс по поводу их нейробазал...

Сори за любопытство. А почему эти среды называются базальными? И зачем в них феноловый красный?

0

03.08.2023

Natalia

Владимир
Сори за любопытство. А почему эти среды называются...

Феноловый красный для визуального контроля рН. Про название не знаю)

0

03.08.2023